تست الایزا

 

آنتی ژن ترکیب پلی ساکاریدیا پروتینی است که میتواند باعث تولید آنتی بادی های خاص گردد و می تواند به طور اختصاصی بر روئ محل های خاصی از آنتی بادی متصل شود به نام پاراتون Antigen banding site هر آنتی بادی دو یا چندین پاراتوپ دارد . آنتی بادی مولکولهای ایونوگلوبین هستند که توسط لنفوسید های B یک حیوان در پاسخ به یک محرک آنتی ژن تولید شده و قادرند به یک آنتی ژن متصل شوند . اپیتوپ antigentic leterminent   a. site  محلی از مولکول آنتی ژن است که قادربه تحریک تولید آنتی بادی بوده و به طور اختصاصی به آنتی بادی متصل میشود . هر آنتی ژن یک یا چند اپی توپ دارد هر پاراتوپ یک اپی توپ را تشخیص میدهد مولکولهای آنتی بادی پنج کلاس دارند

   IgG.IgA.IgM.IgD.IgE

Ig =imunuogolobolin

تست های سرولوژیکی در تشخیص نهایی یک ویروس ناشناخته و مطالعه روابط بین نژادها واسترین های یک ویروس مهم است. اساس این تست ها اتصال هر آنتی بادی با آنتی ژن خاص آن است که یکی از این تستها ELISA است Enzyme link eimuno sorbent assay در این روش آنزیم به آنتی بادی متصل شده و با استفاده از سوبسترای مخصوص آنزیم این آنزیم ردیابی می شود تغییر رنگ ایجاد شده بیانگروجود آنزیم است

 

 

 رایجترین روش الایزا :

 

ساندویچ دو طرفه الایزا

DAS-ELISA

(Double Antibody sandwic ELISA)

در این روش آنتی ژن در بین دو لایه آنتی بادی قرار می گیرد که آنتی بادی ثانویه متصل به آنزیم است

آنزیمی که بیشتر استفاده می شود آنزیم آلکالید فسفاتاز است سوبسترای مخصوص این آنزیم D.nitropheny phosphate است که این سوبسترا توسط آلکالید فسفاتاز هیدرو لیز شده و پارانیترو فنول تشکیل  می شود که زرد رنگ است برای اینکه آنزیم بهتر اثر داشته باشد محیط عمل آنزیم باید قلیایی باشد

 

 بافر های مورد استفاده در روش داس الایزا :

 

بافر پوششی coating buffer

Na2Co3_____1.59gr

NaHco3_____2.9 gr

NaN3_____0.2gr

این مواد ابتدا در حدود 900 سی سی آب مقطر حل کرده سپس PH را باHCL به 9.6 تنظیم سپس با آب مقطر به یک لیتر میرسد که در یخچال قابل ذخیره است ولی قبل از مصرف باید PH آن چک شود.

 

فسفات بافر سالین Phosohate buffer salin (pbs)

Nacl_____8gr

KHcpo4_____0.2gr

Kcl_____0.2gr

Nan3_____0.2gr

grا NaHPO4,2H2O_____1.44gr   Na2HPO4_____1.15gr NaHPO4,12H2O_____2.9

این مواددر 900 سی سی آب مقطر حل سپس PHرا باNaoH یاHCL به 7.4 تنظیم و سپس حجم آن را با آب مقطر به 1 لیتر می رسانیم.

 

بافر شستشو Washing buffer(PBS_T)

PH=7.2 -7.4

PBS=1 lit

Twee20=0.5 cc

 

بافر استخراجی(بافر نمونه یا بافر عصارگیری )

Extra ction b.

 (PBS_TPO)

PBS_T=1lit

PVP=20gr

OVAL BAMIN=2gr

 

بافر استخراجی

هیدروکسی متیل آمینو متان(تریس)=2.3 gr

NaCL=8gr

PVP=2gr

T_20=0.5 cc

KCL=0.2gr

NAN3=0.2gr

PH=7.4 حجم محلول را با آب مقطر به یک لیتر می رسانیم.

 

 

بافر استخراجی مخصوص غده پیاز و بذر کاهو

بافر استخراجی بالا=100cc

آلبومین تخم مرغ =10 gr

 

بافر استخراجی برای انگور

تریس =2.3gr

تریسHCL=37.2gr

NaCL=8gr

PEG(600MW)=10 GR

PVP=20gr

T_20=0.5cc

NaN3=0.2gr

در یک لیتر آب مقطر حل میکنیم وPHآن را به 8.2میرسانیم.

 

بافر کانژوگهCanjugate buffer             Ab-E 

که اتصال آنتی بادی آنزیم میباشد معمولااز بافر استخراجی شماره 1 برای تهیه کانژوگه استفاده می شود

NaCL=8gr

T_20=0.5cc

NgCL6H2O=0.2gr

NaN3=0.2gr

تریس =2.4gr

KCL=0.2gr

PVP=20gr

BSA=2gr(bovine serum albumine

که PHآن را به 7.4میرسانیم و حجم آن را با آب مقطر به 1000 سی سی ميرسانیم

 

بافر سوبسترا Substrate buffer

دی اتانول آمین =97cc

آب مقطر=800cc

NaN3=0.2gr

PHرا با HCLبه 9.8تنظیم می کنیم سپس حجم آن را با آب مقطر به یک لیتر می رسانیم.

پلیت دارای 96 چاهک است که جنس  آن از پلی استرن یا پلی ونیل است که در نوع پلی استرن واکنش های غیر اختصاصی کمتری اتفاق می افتد . در بعضی موارد کف چاهک تخت است و بعضی به صورت زاویه ای است هر کیت پلیت مخصوصی دارد .

 

 

مراحل تست DAS ELISA

·            مرحله اول : ابتدا آنتی بادی در بافر پوششی بر اساس نسبتی که مشخص شده رقیق شدهسپس در هر چاهک 100Mlitیا200 Mlit ریخته میشود بعد از ریختن آنتی بادی در چاهک ها پلیت ها به مدت معمولا 4ساعت در 37درجه یا در بعضی مواقع بین 2-4 ساعت در یک انکوباتور مرطوب نگه داری می شود بعد از ریختن آنتی بادی روی پلیت با پارافیلم پوشش داده میشود بعد از اتمام انکوباتور محتویات چاهک ها خالی شده و چاهک ها با بافر شستشو شسته می شوند .

·            مرحله دوم: هر چاهک حداقل 3 بار به مدت 3دقیقه شسته می شود .آنتی بادی ها به دیواره شیشه چسبیده می شود در شستشو اضافی ها حذف می شود که بهcoatingمعروف است.

·            مرحله سوم در هر چاهک 100-200Mlitعصاره لوله ریخته میشود و شپش پلیت را با پارافیلم پوشش داده و یک شب در دمای 4درجه یخچال نگه داری میشود .نمونه های گیاهی به نسبت 1;3 W/Gدر بافر استخراجی با استفاده از هاون یا داخل پلاستیک ضخیم له شده وعصاره گیری می شود در زمان ریختن عصاره ها در چاهک برای هر نمونه از یک نوع سمپله استفاده میشود. معمولا از هر نمونه گیاهی 2تکرار گذاشته میشود در برخی از چاهک ها از نمونه های کنترل مثبت و منفی استفاده میشود . میتوانید بعد از اولین شستشو پلیت ها را در دمای -20 درجه برای چند هفته نگه داری کنیم

·            مرحله چهارم: بعد از اتمام انکوباتور شستشو مطابق قبل که باید دقت شود عصاره چاهک ها با هم تلفیق نشوند

·            مرحله پنجم :کانژوگه (اتصال آنزیم آنتی بادی در بافر مخصوص )قسمت مشخص شده رقیق می شود سپس در هر چاهک 100-200Mlit ریخته میشود ودر دمای 37 درجه به مدت4ساعت یا 3-6ساعت در دمای 37درجه نگه داری می شود انکوباتور باید مرطوب باشد

·            مرحله ششم : شستشو مطابق مرحله دوم انجام می شود چون اگر درست انجام نشود آنزیم های آزاد واکنش خواهند داد.

·            مرحله هفتم : سوبسترا به غلظت 1 میلی گرم در لیتر در بافر سوبسترا حل شده و در هر چاهک 100-200Mlit   ریخته می شود بافر باید تازه تهیه شده باشد . بعد از ریختن سوبسترا پلیت در دمای اطاق و تاریکی به مدت 120-30 دقیقه نگه داری میشود باید مطمئن باشیم که تمام وسایل مورد استفاده فاقد آلکالید فسفات باشد سطوح دست و پوست دارای آلکالید فسفاتاز انسانی است .سوبستره نشان می دهد که آنزیمی وجود دارد که به سوبستره متصل است یعنی تغییر رنگ نشان می دهد که آنتی ژن وجود دارد .جهت توقف واکنش ها در هر چاهک 50MLITهیدراکسید سدیم بریزید در پایان تفسیر نتایج وجود دارد که به صورت کیفی یا کمی بیان میشود در حالت کیفی نمونه ها را با کنترل مثبت شاهد مقایسه می کنیم اگر تغییر رنگ قابل ملاحظه باشد ویروس وجود دارد در حالت کمی باید از دستگاه ELISA-READER استفاده می شود که میزان جذب نور در تک تک چاهک ها قرائت میشود.

توئین 20 پاک کننده غیر یونی میباشد که بعد از افزودن آنتی بادی ممکن است به سطح چاهک های پلیت اتصالات غیر سرولوژیکی رخ دهد twee20 از این اتصالات جلو گیری می کند

 

PVP  polyoxye thylene soibitan morolaurate :شدت واکنش های غیر اختصاصی را کاهش می دهد به پلی فنولهایی که ممکن است ساختمان آنتی ژنی ویروس را تغییر دهند متصل میشود

آلبومین تخم مرغ BSA وژلاتین وشیر خشک بدون چربی که به آنها عوامل بلوکه میگویند . این ترکیبات با آنتی ژن های ویروسی وگیاهی جهت اشغال محل های خالق چاهک رقابت میکنند

 

 

بررسی حالت کیفی بر اساس میزان تغییر رنگ

مشکلات در رابطه با این موضوع

 

الف: ممکن است هیچ گونه تغییر رنگی ایجاد نشود و میزان جذب نور پایین باشد

1: دلیل آن این است که یا یکی از مراحل آزمون فراموش شده است یا مراحل به درستی پشت سر هم انجام نشده است

2: ممکن است در هر مرحله از بافر محلول آن مرحله استفاده نشده باشد

3:ممکن است آنتی بادی یا آنزیم مورد استفاده سالم نباشد

4:ممکن است بافر ایراد داشته باشد (قدیمی باشد یا آلودگی داشته باشد که برای رفع این موضوع از NaN3استفاده میشود )

5: غلظت آنتی بادی و کانژوگه درست تهیه نشده باشد

 

 

ب: تغییر رنگ غییر اختصاصی دیده میشود که چند حالت دارد

1:این تغییر رنگ ها در چاهک های اطراف پلیت مشاهده می شود برای حل این مشکل از بالا بودن رطوبت یا رطوبت انکوباتور به حد کافی مطلع باشیم

2: اگر رطوبت کمک نمیکند چاهک های حاشیه را یا استفاده نمی کنیم یا آنها را با بافر پر می کنیم

out-vow–effect ;edge-effect   اثر حاشیه ای هستند اگر در کل پلیت واکنش های غیر اختصاصی دیده شود دلیل آن شستشوی ناقص است و همچنین سوبسترای آن تازه نبوده و کانژوگه به خوبی دیالیز نشده و حاوی گلوترآلدیید است ممکن است PHبافر ها تنظیم نبوده است و همچنین پلیت ها به خوبی پوشش داده نشده اند . شستن پلیت ها خیلی مهم است و ممکن است به صورت دستی یا ماشینی باشد هنگام شستن پلیت ها به صورت دستی باید به سرعت برگردانده شود به طوری که محتویات چاهک ها با هم مخلوط نشده باشند سپس پلیت ها را روی بافت جذب کننده مانند دستمال زده میشود تا محتویات باقی مانده در چاهک ها خشک شود شستشوی پلیت ها پس از افزودن عصاره کانژوگه بسیار مهم است و باید به دقت شسته شود

3: در برخی چاهک ها واکنش های غیراختصاصی دیده میشود که یا شستشو ناقص بوده یا محتویات چاهک ها با هم مخلوط شده اند باید دقت شود هنگام حمل ونقل محتویات پلیت ها با هم مخلوت نشوند

 

 

ج:تغییر رنگ بسیار سریع اتفاق می افتد و نمونه های سالم تغییر رنگ می دهند که علت آن بالا بودن غلظت کانژوگه یا سوبسترا است

تذکر : هرگز پلیت ها را به صورت خالی رها نکنید این عمل باعث کاهش حساسیت آزمون میشود و میتوانید آنها را با بافر شستشو موقتا پر کنید یا به صورت معکوس در پارچه مرطوب قرار دهیم

 

 

اندازه گیری کمی :

میزان جذب نور در هر چاهک قرائت میشود معمولا شدت رنگ در طول موج 405nmاندازه گیری میشود اگر دستگاه الایزا ریدر با فیلتر های دوتایی کار کند پیشنهاد میشود در طول موج 405,492nmقرائت شود

این عمل در 405nmباعث کاهش واکنش های غیر اختصاصی میشود .

میزان جذب نور یا  OD بر اساس گونه رقم و بافت مورد استفاده شن سشتسو و کیفیت مواد شیمیایی تغییر میکند به منظور تعیین نمونه آلوده به صورت کمی شما به نمونه های کنترل منفی یا سالم نیاز دارید و باید از ابتدا حد آستانه آلودگی را مشخص بکنیم و هر نمونه ای که میزان OD آن از حد آستانه بالا تر باشد آن نمونه آلوده است اگر از یک نمونه چند تکرار داشته باشیم باید متوسط جذب تکرار ها از حد آستانه بالا تر باشد تا بگوییم نمونه آلوده است . از آنجا کهغلظت پاتوژن به گونه های گیاهی واریته شرایط محیطی سن فیزیولوژیکی گیاه نوع  بافت نگه داری نمونه ها ونحوه عصاره گیری بستگی دارد بنابر این پیشنهاد می شود جهت محاسبه سطح آستانه آلودگی از کنترل های مثبت و منفی همان نوع گیاه در بافتی که بررسی می کنیم استفاده شود.

بر اساس مواد مورد استفاده .خلوص مواد شیمیایی حمل ونقل پلیت ها به خصوص هنگام شستشو و شرایط انکوباسیون واکنش های غیر اختصاصی متفاوتی در پلیت ها حتی برای یک پاتوژن رخ می دهد بنابراین لازم است حد آلودگی تعیین گردد

حد آستانه آلودگی =متوسط جذب نمونه های سالم در چاهک A1-D1 *3

حد آستانه آلودگی =متوسط جذب نمونه های سالم+3برابر انحراف معیار نمونه های سالم

(که حداقل باید 5 نمونه سالم کنترل شده داسته باشیم )

بنابراین.این داده ها به شما کمک میکند که از منفی های دروغین جلوگیری کنید یعنی ممکن است یک نمونه در روش کیفی منفی در نظر گرفته شود ولی در روش کمی این نمونه مثبت خواهد شد .

حساسیت تست الایزا 1-10ng است

 

 

 

محاسبات:

 

بافر پوششی برای 5سی سی

Ab=1:300

Canjoge=1:300

Na2Co3_____1.59gr=0.008gr

NaHco3_____2.9 gr=0.00145gr

NaN3_____0.2gr=0.001gr

5cc+آب مقطر300

16.5   5000                  5000-16.5=4983.3   buffer

1

6.5Ml     Ab

 

فسفات بافر سالین Phosohate buffer salin (pbs)

برای 200 سی سی

Nacl_____8gr=1.6

KHcpo4_____0.2gr=0.04

Kcl_____0.2gr=0.04

Nan3_____0.2gr  =0.04

Na2HPO4_____1.15gr =0.0023

 

بافر شستشو Washing buffer(PBS_T)

PH=7.2 -7.4

PBS=1 lit

TWEE20_____0.5=0.075

 

 

بافر استخراجی(بافر نمونه یا بافر عصارگیری )Extra ction b. (PBS_TPO)

PBS_T=1lit____100cc

PVP=20gr_____2gr

OVAL BAMIN=2gr____0.2gr

 

بافر سوبسترا Substrate buffer

دی اتانول آمین =97cc___0.485

آب مقطر=800cc_____4

NaN3=0.2gr____0.01

|+| نوشته شده توسط فلامک خلیلی در 84/11/23 ساعت 21:55 |